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Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Spain * 이 저자들은 이 작업에 대한 몇 가지 통찰력을 가지고 있습니다. Equal 기여 배경: 히알루론산(HA)은 미용 목적을 위한 피부 필러 생산에 사용되는 자연 발생 다당류입니다.인체 조직에서 수일의 반감기가 있기 때문에 HA 기반 피부 필러는 체내에서 수명을 연장하기 위해 화학적으로 변형됩니다.상업용 HA 기반 충전제의 가장 일반적인 변형은 HA 사슬을 가교하기 위한 가교제로 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE)를 사용하는 것입니다.잔류 또는 미반응 BDDE는 2ppm 미만에서 무독성으로 간주됩니다.따라서 최종 피부 필러에 남아 있는 BDDE를 정량화하여 환자의 안전을 보장해야 합니다.재료 및 방법: 이 연구는 액체 크로마토그래피와 질량 분석법(LC-MS)을 결합하여 알칼리 조건에서 BDDE와 HA 사이의 가교 반응 부산물의 검출 및 특성화에 대해 설명합니다.결과: 다양한 분석 후, HA-BDDE 하이드로겔을 소독하는 데 사용된 알칼리성 조건과 고온이 이 새로운 부산물인 "프로필렌 글리콜 유사" 화합물의 형성을 촉진한다는 것이 밝혀졌습니다.LC-MS 분석을 통해 부산물이 BDDE와 동일한 단일 동위원소 질량, 다른 머무름 시간(tR) 및 다른 UV 흡광도(λ=200 nm) 모드를 가짐을 확인했습니다.BDDE와 달리 LC-MS 분석에서는 동일한 측정 조건에서 이 부산물이 200nm에서 더 높은 검출률을 보이는 것으로 관찰되었습니다.결론: 이러한 결과는 이 새로운 화합물의 구조에 에폭사이드가 없음을 나타냅니다.상업적 목적의 HA-BDDE 하이드로겔(HA 피부 필러) 생산에서 발견되는 이 새로운 부산물의 위험을 평가하기 위한 논의가 열려 있습니다.Keywords: 히알루론산, HA 더마필러, 가교히알루론산, BDDE, LC-MS 분석, BDDE 부산물.
히알루론산(HA) 기반 필러는 미용 목적으로 사용되는 가장 일반적이고 인기 있는 피부 필러입니다.1 이 피부 필러는 일반적으로 >95%의 물과 0.5-3%의 HA로 구성된 하이드로겔로 젤과 같은 구조를 제공합니다.2 HA는 다당류이며 척추동물의 세포외 기질의 주성분입니다.성분 중 하나입니다.글리코시드 결합으로 연결된 (1,4)-글루쿠론산-β(1,3)-N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 반복 이당류 단위로 구성됩니다.이 이당류 패턴은 모든 유기체에서 동일합니다.일부 단백질 기반 충전제(예: 콜라겐)와 비교할 때 이 특성으로 인해 HA는 생체 적합성이 높은 분자입니다.이러한 충전제는 환자의 면역 체계에 의해 인식될 수 있는 아미노산 서열 특이성을 나타낼 수 있습니다.
진피 필러로 사용할 때 HA의 주요 한계는 히알루로니다제라고 하는 특정 효소 계열의 존재로 인해 조직 내에서 빠르게 회전한다는 것입니다.지금까지 HA 구조의 몇 가지 화학적 변형이 조직에서 HA의 반감기를 증가시키는 것으로 설명되었습니다.3 이러한 변형의 대부분은 HA 사슬을 교차 연결하여 다당류 중합체에 대한 히알루로니다제의 접근을 감소시키려는 시도입니다.따라서 가교의 형성과 HA 구조와 가교제 사이의 분자간 공유 결합으로 인해 가교된 HA 하이드로겔은 천연 HA보다 더 많은 항효소 분해 생성물을 생성합니다.4-6
지금까지 가교된 HA를 생성하기 위해 사용된 화학적 가교제는 메타크릴아미드, 7 히드라지드, 8 카르보디이미드, 9 디비닐 술폰, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE) 및 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르를 포함합니다.10,11 BDDE는 현재 가장 일반적으로 사용되는 가교제입니다.이러한 유형의 하이드로겔은 수십 년 동안 안전한 것으로 입증되었지만 사용된 가교제는 세포독성이 있고 일부 경우에는 돌연변이를 유발할 수 있는 반응성 시약입니다.12 따라서 최종 하이드로겔의 잔류 함량이 높아야 합니다.BDDE는 잔류 농도가 2ppm 미만일 때 안전한 것으로 간주됩니다.4
가스 크로마토그래피, 질량 분석법(MS)과 결합된 크기 배제 크로마토그래피, 핵자기 공명(NMR) 형광 측정 방법, 다이오드 어레이 결합 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC).13-17 이 연구는 알칼리 조건에서 BDDE와 HA의 반응에 의해 생성된 최종 가교 HA 하이드로겔에서 부산물의 검출 및 특성화에 대해 설명합니다.HPLC 및 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS 분석).이 BDDE 부산물의 독성은 알려져 있지 않으므로 최종 제품의 BDDE에 대해 일반적으로 수행되는 방법과 유사한 방식으로 잔류물 정량을 결정하는 것이 좋습니다.
얻어진 HA의 나트륨염(Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan)은 분자량이 ~1,368,000 Da(Laurent 방법) 18이고 고유 점도는 2.20 m3/kg입니다.가교 반응을 위해 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 BDDE(≥95%)를 구입했습니다.pH 7.4의 인산염 완충 식염수는 Sigma-Aldrich Company에서 구입했습니다.LC-MS 분석에 사용된 모든 용매, 아세토니트릴 및 물은 HPLC 등급 품질에서 구입했습니다.포름산(98%)은 시약 등급으로 구입합니다.
모든 실험은 UPLC Acquity 시스템(Waters, Milford, MA, USA)에서 수행되었으며 전자분무 이온화 소스(AB SCIEX, Framingham, MA, USA)가 장착된 API 3000 삼중 사중극자 질량 분석기에 연결되었습니다.
가교 HA 하이드로겔의 합성은 1% 알칼리(수산화나트륨, NaOH)의 존재 하에 10%(w/w) 히알루론산나트륨(NaHA) 용액에 198mg의 BDDE를 첨가함으로써 시작되었습니다.반응 혼합물의 최종 BDDE 농도는 9.9mg/mL(0.049mM)였습니다.그 다음, 반응 혼합물을 완전히 혼합하고 균질화하고 45℃에서 4시간 동안 진행시켰다.19 반응의 pH는 ~12로 유지됩니다.
그 후, 반응 혼합물을 물로 세척하고, 최종 HA-BDDE 하이드로겔을 여과하고 PBS 완충액으로 희석하여 10 내지 25 mg/mL의 HA 농도 및 7.4의 최종 pH를 달성하였다.생성된 가교 HA 하이드로겔을 살균하기 위해 이 모든 하이드로겔을 고압멸균 처리합니다(120°C에서 20분).정제된 BDDE-HA 하이드로겔은 분석할 때까지 4°C에서 보관됩니다.
가교된 HA 생성물에 존재하는 BDDE를 분석하기 위해, 240 mg 샘플을 칭량하고 중앙 구멍(Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; 부피 0.5 mL)에 도입하고 실온에서 10,000 rpm으로 원심분리했습니다. 10분.총 20 μL의 풀다운 액체를 수집하여 분석했습니다.
알칼리 조건(1%, 0.1% 및 0.01% NaOH)에서 BDDE 표준물질(Sigma-Aldrich Co)을 분석하기 위해 다음 조건이 충족되면 액체 샘플은 1:10, 1:100 또는 최대 1:1,000,000 필요한 경우 MilliQ 탈이온수를 사용하여 분석합니다.
가교 반응에 사용된 출발 물질(HA 2%, H2O, 1% NaOH 및 0.049mM BDDE)에 대해, 이들 물질로부터 제조된 각 샘플 1mL를 동일한 분석 조건을 사용하여 분석하였다.
이온 맵에 나타나는 피크의 특이성을 확인하기 위해 100ppb BDDE 표준 용액(Sigma-Aldrich Co) 10μL를 20μL 샘플에 추가했습니다.이 경우 각 시료의 최종 표준 농도는 37ppb입니다.
먼저, 표준 BDDE(Sigma-Aldrich Co) 10 μL을 990 μL MilliQ 물(밀도 1.1 g/mL)로 희석하여 11,000 mg/L(11,000 ppm) 농도의 BDDE 스톡 용액을 준비합니다.이 용액을 사용하여 중간 표준 희석액으로 110µg/L(110ppb) BDDE 용액을 준비합니다.그런 다음 중간 BDDE 표준 희석제(110ppb)를 사용하여 원하는 농도 75, 50, 25, 10 및 1ppb를 달성하기 위해 중간 희석제를 여러 번 희석하여 표준 곡선을 작성합니다.그림 1과 같이 1.1~110ppb의 BDDE 표준곡선은 선형성이 좋은 것을 알 수 있습니다(R2>0.99).표준 곡선은 4번의 독립적인 실험에서 반복되었습니다.
그림 1 LC-MS 분석으로 얻은 BDDE 표준 검량선에서 좋은 상관 관계가 관찰되었습니다(R2>0.99).
약어: BDDE, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르;LC-MS, 액체 크로마토그래피 및 질량 분석기.
가교된 HA에 존재하는 BDDE 표준물질과 기본 용액에 존재하는 BDDE 표준물질을 확인하고 정량화하기 위해 LC-MS 분석을 이용하였다.
크로마토그래피 분리는 LUNA 2.5 µm C18(2)-HST 컬럼(50×2.0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA)에서 이루어졌으며 분석하는 동안 실온(25°C)에서 유지되었습니다.이동상은 0.1% 포름산을 포함하는 아세토니트릴(용매 A)과 물(용매 B)로 구성됩니다.이동상은 기울기 용출에 의해 용리됩니다.기울기는 다음과 같습니다: 0분, 2% A;1분, 2% A;6분, 98% A;7분, 98% A;7.1분, 2% A;10분, 2% A. 실행 시간은 10분이고 주입량은 20μL입니다.BDDE의 머무름 시간은 약 3.48분(실험에 따라 3.43~4.14분 범위)입니다.이동상은 LC-MS 분석을 위해 0.25mL/min의 유속으로 펌핑되었습니다.
MS에 의한 BDDE 분석 및 정량화를 위해 UPLC 시스템(Waters)을 전자분무 이온화 소스가 장착된 API 3000 삼중 사중극자 질량 분석기(AB SCIEX)와 결합하고 분석을 양이온 모드(ESI+)에서 수행합니다.
BDDE에서 수행한 ion fragment 분석에 따르면 가장 높은 세기의 fragment가 129.1 Da에 해당하는 fragment로 결정되었다(Figure 6).따라서 정량을 위한 다중 이온 모니터링 모드(MIM)에서 BDDE의 질량 변환(질량 대 전하 비율[m/z])은 203.3/129.1 Da입니다.또한 LC-MS 분석을 위해 전체 스캔(FS) 모드와 생성 이온 스캔(PIS) 모드를 사용합니다.
방법의 특이성을 확인하기 위해 블랭크 샘플(초기 이동상)을 분석했습니다.203.3/129.1 Da의 질량 변환으로 블랭크 샘플에서 신호가 감지되지 않았습니다.실험의 반복성과 관련하여 55ppb(검량 곡선 중간)의 10번의 표준 주입이 분석되었으며 결과적으로 잔류 표준 편차(RSD) <5%(데이터는 표시되지 않음)가 되었습니다.
잔류 BDDE 함량은 4개의 독립적인 실험에 해당하는 8개의 다른 오토클레이브 BDDE 가교 HA 하이드로겔에서 정량화되었습니다."재료 및 방법" 섹션에 설명된 대로 정량화는 203.3/129.1 Da의 BDDE 질량 전이에서 검출된 고유한 피크에 해당하는 BDDE 표준 희석의 회귀 곡선의 평균값으로 평가됩니다. 3.43~4.14분의 시간 대기하지 않음.그림 2는 10ppb BDDE 참조 표준물질의 크로마토그램 예를 보여줍니다.표 1은 8가지 다른 하이드로겔의 잔류 BDDE 함량을 요약한 것입니다.값 범위는 1~2.46ppb입니다.따라서 샘플의 잔류 BDDE 농도는 사람이 사용하기에 적합합니다(<2ppm).
그림 2 10ppb BDDE 참조 표준물질(Sigma-Aldrich Co), 203.30/129.10Da(양성 MRM 모드)의 LC-MS 분석으로 얻은 MS(m/z) 전이의 이온 크로마토그램.
약어: BDDE, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르;LC-MS, 액체 크로마토그래피 및 질량 분석기;MRM, 다중 반응 모니터링;MS, 질량;m/z, 질량 대 전하 비율.
참고: 샘플 1-8은 고압멸균된 BDDE 가교 HA 하이드로겔입니다.하이드로겔에 남아 있는 BDDE의 양과 BDDE 머무름 시간의 피크도 보고됩니다.마지막으로, 머무름 시간이 다른 새로운 피크의 존재도 보고됩니다.
약어: BDDE, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르;HA, 히알루론산;MRM, 다중 반응 모니터링;tR, 체류 시간;LC-MS, 액체 크로마토그래피 및 질량 분석기;RRT, 상대 체류 시간.
놀랍게도, LC-MS 이온 크로마토그램의 분석은 분석된 모든 오토클레이브 가교된 HA 하이드로겔 샘플을 기반으로 하여 2.73분에서 3.29분의 더 짧은 머무름 시간에 추가 피크가 있음을 보여주었습니다.예를 들어, 그림 3은 약 2.71분의 다른 머무름 시간에 추가 피크가 나타나는 가교 HA 샘플의 이온 크로마토그램을 보여줍니다.새로 관찰된 피크와 BDDE의 피크 사이에 관찰된 상대 체류 시간(RRT)은 0.79로 밝혀졌습니다(표 1).새로 관찰된 피크가 LC-MS 분석에 사용된 C18 컬럼에서 덜 유지된다는 것을 알고 있기 때문에 새로운 피크는 BDDE보다 극성 화합물에 해당할 수 있습니다.
그림 3 LC-MS(MRM 질량 변환 203.3/129.0 Da)로 얻은 가교 HA 하이드로겔 샘플의 이온 크로마토그램.
약어: HA, 히알루론산;LC-MS, 액체 크로마토그래피 및 질량 분석기;MRM, 다중 반응 모니터링;RRT, 상대 체류 시간;tR, 체류 시간.
관찰된 새로운 피크가 사용된 원료에 원래 존재하는 오염 물질일 수 있다는 가능성을 배제하기 위해 이러한 원료도 동일한 LC-MS 분석 방법을 사용하여 분석했습니다.분석된 출발 물질은 물, 수중 NaHA 2%, 수중 NaOH 1% 및 가교 반응에 사용된 동일한 농도의 BDDE를 포함합니다.사용된 출발 물질의 이온 크로마토그램은 화합물이나 피크를 나타내지 않았으며, 머무름 시간은 관찰된 새로운 피크에 해당합니다.이 사실은 출발 물질이 분석 절차를 방해할 수 있는 화합물이나 물질을 포함할 수 있을 뿐만 아니라 다른 실험실 제품과의 교차 오염 가능성의 징후가 없다는 생각을 무시합니다.BDDE 및 새로운 피크의 LC-MS 분석 후 얻은 농도 값은 표 2(샘플 1-4)와 이온 크로마토그램은 그림 4에 나와 있습니다.
참고: 샘플 1-4는 오토클레이브 BDDE 가교 HA 하이드로겔을 생산하는 데 사용되는 원료에 해당합니다.이 샘플은 오토클레이브되지 않았습니다.
약어: BDDE, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르;HA, 히알루론산;LC-MS, 액체 크로마토그래피 및 질량 분석기;MRM, 다중 반응 모니터링.
그림 4는 HA와 BDDE의 가교 반응에 사용된 원료 시료의 LC-MS 크로마토그램에 해당합니다.
참고: 이들 모두는 가교 반응을 수행하는 데 사용된 동일한 농도 및 비율로 측정됩니다.크로마토그램으로 분석한 원료의 숫자는 (1) 물, (2) 2% HA 수용액, (3) 1% NaOH 수용액에 해당합니다.LC-MS 분석은 203.30/129.10 Da의 질량 변환에 대해 수행됩니다(양성 MRM 모드에서).
약어: BDDE, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르;HA, 히알루론산;LC-MS, 액체 크로마토그래피 및 질량 분석기;MRM, 다중 반응 모니터링.
새로운 봉우리가 형성되는 조건을 연구했습니다.가교 HA 하이드로겔을 생성하는 데 사용된 반응 조건이 BDDE 가교제의 반응성에 어떻게 영향을 미쳐 새로운 피크(가능한 부산물)가 형성되는지 연구하기 위해 다양한 측정을 수행했습니다.이러한 결정에서 우리는 수성 매질에서 다양한 농도의 NaOH(0%, 1%, 0.1%, 0.01%)로 처리한 후 고압멸균 처리하거나 처리하지 않은 최종 BDDE 가교제를 연구하고 분석했습니다.동일한 조건을 시뮬레이션하기 위한 박테리아 절차는 가교 HA 하이드로겔을 생산하는 데 사용된 방법과 동일합니다."재료 및 방법" 섹션에 설명된 대로 샘플의 질량 전이는 LC-MS에 의해 203.30/129.10 Da로 분석되었습니다.BDDE와 새로운 피크의 농도를 계산하고 그 결과를 표 3에 나타내었다. 용액 내 NaOH의 존재 여부와 상관없이 오토클레이브되지 않은 샘플에서는 새로운 피크가 검출되지 않았다(샘플 1-4, 표 삼).오토클레이브 샘플의 경우, 새로운 피크는 용액에 NaOH가 있을 때만 감지되며 피크 형성은 용액(샘플 5-8, 표 3)(RRT = 0.79)의 NaOH 농도에 따라 달라집니다.그림 5는 이온 크로마토그램의 예를 보여주며, NAOH의 유무에 관계없이 두 개의 고압멸균된 샘플을 보여줍니다.
약어: BDDE, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르;LC-MS, 액체 크로마토그래피 및 질량 분석기;MRM, 다중 반응 모니터링.
참고: 상단 크로마토그램: 샘플을 0.1% NaOH 수용액으로 처리하고 오토클레이브(120°C에서 20분)했습니다.하단 크로마토그램: 샘플을 NaOH로 처리하지 않고 동일한 조건에서 고압증기멸균했습니다.203.30/129.10 Da(양성 MRM 모드에서)의 질량 전환을 LC-MS로 분석했습니다.
약어: BDDE, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르;LC-MS, 액체 크로마토그래피 및 질량 분석기;MRM, 다중 반응 모니터링.
NaOH 유무에 관계없이 모든 오토클레이브 샘플에서 BDDE 농도는 크게 감소했습니다(최대 16.6배)(샘플 5-8, 표 2).BDDE 농도의 감소는 고온에서 물이 염기(친핵체)로 작용하여 BDDE의 에폭사이드 고리를 열어 1,2-디올 화합물을 형성할 수 있기 때문일 수 있습니다.이 화합물의 단동위원소 품질은 BDDE의 품질과 다르므로 영향을 받지 않습니다.LC-MS는 203.30/129.10 Da의 질량 이동을 감지했습니다.
마지막으로, 이 실험은 새로운 피크의 생성이 BDDE, NAOH 및 오토클레이브 프로세스의 존재에 의존하지만 HA와는 아무 관련이 없음을 보여줍니다.
약 2.71분의 머무름 시간에서 발견된 새로운 피크를 LC-MS로 특성화했습니다.이를 위해, BDDE(9.9 mg/mL)를 1% NaOH 수용액에서 배양하고 오토클레이브하였다.표 4에서 새로운 피크의 특성은 알려진 BDDE 기준 피크(보유 시간 약 3.47분)와 비교됩니다.두 피크의 이온 단편화 분석을 기반으로 하면 머무름 시간이 2.72분인 피크가 BDDE 피크와 동일한 단편을 보여주지만 강도는 다르다는 결론을 내릴 수 있습니다(그림 6).2.72분의 머무름 시간(PIS)에 해당하는 피크의 경우 147 Da의 질량에서 단편화 후 더 강한 피크가 관찰되었습니다.이 측정에 사용된 BDDE 농도(9.9mg/mL)에서 자외선 스펙트럼의 다양한 흡광도 모드(UV, λ=200nm)도 크로마토그래피 분리 후에 관찰되었습니다(그림 7).머무름 시간이 2.71분인 피크는 200nm에서 여전히 볼 수 있지만 BDDE 피크는 동일한 조건의 크로마토그램에서 관찰할 수 없습니다.
표 4: 머무름 시간이 약 2.71분인 새로운 피크와 머무름 시간이 3.47분인 BDDE 피크의 특성화 결과
참고: 이러한 결과를 얻기 위해 두 개의 피크에 대해 LC-MS 및 HPLC 분석(MRM 및 PIS)을 수행했습니다.HPLC 분석을 위해 200 nm 파장의 UV 검출이 사용됩니다.
약어: BDDE, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르;HPLC, 고성능 액체 크로마토그래피;LC-MS, 액체 크로마토그래피 및 질량 분석기;MRM, 다중 반응 모니터링;m/z, 질량 대 전하 비율;PIS, 제품 이온 스캐닝;자외선, 자외선.
참고: 질량 조각은 LC-MS 분석(PIS)으로 얻은 것입니다.상단 크로마토그램: BDDE 표준 샘플 조각의 질량 스펙트럼.하단 크로마토그램: 감지된 새 피크의 질량 스펙트럼(BDDE 피크와 관련된 RRT는 0.79임).BDDE를 1% NaOH 용액에서 처리하고 오토클레이브했습니다.
약어: BDDE, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르;LC-MS, 액체 크로마토그래피 및 질량 분석기;MRM, 다중 반응 모니터링;PIS, 제품 이온 스캔;RRT, 상대 체류 시간.
그림 7 203.30 Da 전구체 이온의 이온 크로마토그램, (A) 머무름 시간이 2.71분인 새로운 피크 및 (B) 200 nm에서 3.46분에 BDDE 기준 표준 피크의 UV 검출.
생성된 모든 가교 HA 하이드로겔에서 LC-MS 정량화 후 잔류 BDDE 농도가 <2 ppm인 것으로 관찰되었지만 분석에서 새로운 미지의 피크가 나타났습니다.이 새로운 피크는 BDDE 표준 제품과 일치하지 않습니다.BDDE 표준 제품도 positive MRM 모드에서 동일한 품질 변환(MRM 변환 203.30/129.10 Da) 분석을 거쳤습니다.일반적으로 크로마토그래피와 같은 다른 분석 방법은 하이드로겔에서 BDDE를 검출하기 위한 한계 테스트로 사용되지만 최대 검출 한계(LOD)는 2ppm보다 약간 낮습니다.한편, 지금까지 NMR 및 MS는 가교 HA 생성물의 당 단위 단편에서 HA의 가교 및/또는 변형 정도를 특성화하는데 사용되어 왔다.이러한 기술의 목적은 이 기사에서 설명한 것처럼 낮은 농도에서 잔류 BDDE 검출을 정량화하는 것이 아닙니다(LC-MS 방법의 LOD = 10ppb).
게시 시간: 2021년 9월 1일